شامیک مور در نقش مایلز مورالز (مرد عنکبوتی)، هیلی استاینفلد در نقش گوئن استیسی (اسپایدر-گوئن)، اسکار آیزاک در نقش اسپایدرمن ۲۰۹۹ (میگل اوهارا)، جیک جانسون در نقش پیتر بی پارکر (مرد عنکبوتی)، ایسا رای در نقش جسیکا درو (اسپایدروومن)، لونا لورن ولز و برایان تایری هنری، از جمله بازیگرانی هستند که به‌عنوان صداپیشه در انیمیشن Spider-Man: Across the Spider-Verse حضور دارند. فیل لرد و کریستوفر میلر نیز به‌عنوان تهیه‌کننده در دنباله انیمیشن مرد عنکبوتی بازگشته‌اند.
علاوه‌بر مرد عنکبوتی مایلز مورالز و پیتر پارکر، در انیمیشن Spider-Man: Across the Spider-Verse شاهد حضور اسپایدر گوئن، اسپایدرمن ۲۰۹۹ و اسپایدروومن نیز خواهیم بود. پیش از این سونی تایید کرده بود که در انیمیشن جدید مرد عنکبوتی شاهد ۲۴۰ شخصیت خواهیم بود و به ۶ دنیای مختلف سفر خواهیم کرد. این انیمیشن بزرگ‌ترین تیم تولید برای ساخت یک انیمیشن را در اختیار دارد. در یک مقایسه ما در انیمیشن Spider-Man: Into the Spider-Verse شاهد حضور ۴۰ شخصیت بودیم.
طبق تازه‌ترین اخبار سینما و تلویزیون، حضور شخصیت عنکبوتی دیگری در انیمیشن Spider-Man: Across the Spider-Verse فاش شده است. به‌تازگی ۳ تصویر از محصولات تجاری و مرتبط با انیمیشن مرد عنکبوتی 2 فاش و منتشر شده است که در آن شاهد تصویری از شخصیت اسکارلت اسپایدر هستیم. این تصاویر درواقع تایید می‌کند که این شخصیت در انیمیشن Spider-Man: Across the Spider-Verse حضور دارد تا شاهد حضور شخصیت عنکبوتی دیگری در این انیمیشن مورد انتظار باشیم: